INDICE
Come viene rilevato il Coronavirus COVID-19 utilizzando un Tampone Molecolare RT-PCR in tempo reale?
Introduzione
Mentre il coronavirus che causa la malattia COVID-19 si diffonde in tutto il mondo, l’AIEA, in collaborazione con l’Organizzazione delle Nazioni Unite per l’alimentazione e l’agricoltura (FAO), offre il proprio supporto e la propria esperienza per aiutare i paesi a utilizzare la trascrizione inversa in tempo reale: la polimerasi reazione a catena (RT-PCR in tempo reale, ovvero tampone molecolare), uno dei metodi di laboratorio più veloci e accurati per rilevare, tracciare e studiare il virus COVID-19.
Ma cos’è la RT-PCR in tempo reale o tampone molecolare? Come funziona? In cosa differisce dalla PCR? E cosa c’entra questo con la tecnologia nucleare?
Ecco una comoda panoramica della tecnica, come funziona e alcuni dettagli di aggiornamento su virus e genetica.
Che cos’è la RT-PCR in tempo reale?
La RT-PCR in tempo reale o tampone molecolare è un metodo di derivazione nucleare per rilevare la presenza di materiale genetico specifico in qualsiasi agente patogeno, compreso un virus, effettuato presso l’F-Medical group Frosinone. In origine, il metodo utilizzava marcatori di isotopi radioattivi per rilevare materiali genetici mirati, ma il successivo perfezionamento ha portato alla sostituzione dell’etichettatura isotopica con marcatori speciali, più frequentemente coloranti fluorescenti. Questa tecnica consente agli scienziati di vedere i risultati quasi immediatamente mentre il processo è ancora in corso, mentre la RT-PCR convenzionale fornisce i risultati solo alla fine del processo.
La RT-PCR in tempo reale (tampone molecolare) è uno dei metodi di laboratorio più utilizzati per rilevare il coronavirus o COVID-19. Sebbene molti paesi abbiano utilizzato la RT-PCR in tempo reale (tampone molecolare) per diagnosticare altre malattie, come il virus Ebola e il virus Zika, molti hanno bisogno di supporto per adattare questo metodo al alla rilevazione del coronavirus o COVID-19, nonché per aumentare le capacità di test nazionali.
Cos’è un virus? Cos’è il materiale genetico?
Un virus è un pacchetto microscopico di materiale genetico circondato da un involucro molecolare. Questo materiale genetico può essere acido desossiribonucleico (DNA) o acido ribonucleico (RNA).
Il DNA è una molecola a due filamenti che si trova in tutti gli organismi, come animali, piante e virus, e che contiene il codice genetico, o modello, sulla base del quale questi organismi sono fatti e si sviluppano. L’RNA è generalmente una molecola a un filamento che copia, trascrive e trasmette parti del codice genetico alle proteine in modo che possano sintetizzare e svolgere funzioni che mantengono gli organismi in vita e in via di sviluppo. Diverse variazioni di RNA sono responsabili della copia, trascrizione e trasmissione.
Alcuni virus tra cui il coronavirus SARS-CoV-2, che causa COVID-19, contengono solo RNA, il che significa che si basano sull’infiltrazione di cellule sane per moltiplicarsi e sopravvivere. Una volta all’interno della cellula, il virus utilizza il proprio codice genetico – RNA nel caso del virus COVID-19 – per prendere il controllo e “riprogrammare” le cellule, trasformandole in fabbriche di virus.
Affinché un virus come quello del Coronavirus o COVID-19 possa essere rilevato precocemente nel corpo, utilizzando RT-PCR in tempo reale (tampone molecolare), gli scienziati devono convertire l’RNA in DNA. Questo è un processo chiamato “trascrizione inversa“. Lo fanno perché solo il DNA può essere copiato – o amplificato – proprietà fondamentale del processo RT-PCR in tempo reale (tampone molecolare) per rilevare il Coronavirus o COVID-19.
Gli scienziati amplificano una parte specifica del DNA virale trascritto centinaia di migliaia di volte. L’amplificazione è importante in modo che, invece di cercare di individuare una minuscola quantità di virus covid-19 tra milioni di filamenti di informazioni genetiche, gli scienziati abbiano una quantità sufficiente delle sezioni bersaglio del DNA virale per confermare con precisione che il virus è presente.
Come funziona la RT-PCR in tempo reale con il virus COVID-19?
Un campione viene raccolto dalle parti del corpo in cui si raccoglie il virus COVID-19, come il naso o la gola di una persona, per poi essere trattato con diverse soluzioni chimiche che rimuovono sostanze, come proteine e grassi, e che estraggono solo l’RNA presente nel campione. Questo RNA estratto è una miscela del materiale genetico della persona e, se presente, dell’RNA del virus.
L’RNA viene trascritto in modo inverso nel DNA utilizzando un enzima specifico. Gli scienziati aggiungono, quindi, ulteriori brevi frammenti di DNA che sono complementari a parti specifiche del DNA virale trascritto. Se il virus è presente in un campione, questi frammenti si attaccano alle sezioni bersaglio del DNA virale. Alcuni dei frammenti genetici aggiunti vengono utilizzati per costruire filamenti di DNA durante l’amplificazione, mentre gli altri vengono utilizzati per costruire il DNA e aggiungere etichette marcatori ai filamenti, che vengono quindi utilizzati per rilevare il virus.
La miscela viene quindi posta in una macchina RT-PCR. La macchina passa in rassegna temperature che riscaldano e raffreddano la miscela per innescare specifiche reazioni chimiche le quali creano nuove copie identiche delle sezioni bersaglio del DNA virale. Il ciclo viene ripetuto più e più volte per continuare a copiare le sezioni target del DNA virale. Ogni ciclo raddoppia il numero precedente: due copie diventano quattro, quattro copie diventano otto e così via. Una configurazione RT-PCR standard in tempo reale (tampone molecolare) di solito attraversa 35 cicli, questo significa che, alla fine del processo, vengono create circa 35 miliardi di nuove copie delle sezioni di DNA virale da ciascun filamento del virus presente nel campione.
Quando vengono create nuove copie delle sezioni di DNA virale, le etichette dei marker si attaccano ai filamenti di DNA e quindi rilasciano un colorante fluorescente, che viene misurato dal computer della macchina e presentato in tempo reale sullo schermo. Il computer tiene traccia della quantità di fluorescenza nel campione dopo ogni ciclo. Quando un certo livello di fluorescenza viene superato, ciò conferma che il virus è presente. Gli scienziati monitorano anche quanti cicli sono necessari per raggiungere questo livello al fine di stimare la gravità dell’infezione: minore è il numero di cicli, più grave è l’infezione virale.
Perché utilizzare RT-PCR in tempo reale?
La tecnica RT-PCR in tempo reale (tampone molecolare) è altamente sensibile e specifica e può fornire una diagnosi affidabile in appena tre ore, sebbene i laboratori impieghino in media tra le sei e le otto ore. Rispetto ad altri metodi di isolamento dei virus disponibili, la RT-PCR in tempo reale (tampone molecolare) è significativamente più veloce e ha un minore potenziale di contaminazione o errori, poiché l’intero processo può essere eseguito all’interno di una provetta chiusa. Continua ad essere il metodo più accurato disponibile per il rilevamento del virus COVID-19.
Tuttavia, la RT-PCR in tempo reale (tampone molecolare) non può essere utilizzata per rilevare infezioni passate, il che è importante per comprendere lo sviluppo e la diffusione del virus, poiché i virus sono presenti nell’organismo solo per una specifica finestra di tempo. Sono necessari altri metodi per rilevare, monitorare e studiare le infezioni passate, in particolare quelle che possono essersi sviluppate e diffuse senza sintomi.
Che cos’è la PCR e in cosa differisce dalla RT-PCR in tempo reale?
RT – PCR è una variazione della PCR o reazione a catena della polimerasi. Le due tecniche utilizzano lo stesso processo tranne per il fatto che RT-PCR prevede una fase aggiuntiva di trascrizione inversa di RNA in DNA, o RT, per consentire l’amplificazione. Ciò significa che la PCR viene utilizzata per agenti patogeni, come virus e batteri, che contengono già DNA per l’amplificazione, mentre RT-PCR viene utilizzata per quelli contenenti RNA che deve essere trascritto nel DNA per l’amplificazione. Entrambe le tecniche possono essere eseguite in “tempo reale“, il che significa che i risultati sono visibili quasi immediatamente, mentre se usate “convenzionalmente”, i risultati sono visibili solo alla fine della reazione.
La PCR è uno dei test diagnostici più utilizzati per la rilevazione di agenti patogeni, compresi i virus, che causano malattie come Ebola, peste suina africana e afta epizootica. Poiché il virus COVID-19 contiene solo RNA, per rilevarlo viene utilizzata la RT-PCR convenzionale o in tempo reale.
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